30/04/2020      

Se ha hablado mucho de la  importancia de las pruebas analíticas para detener la expansión del coronavirus (virus SARS-Cov-2). Existen diferentes tipos de pruebas que analizan diferentes marcadores de la presencia actual del virus en el organismo (infección activa) o de haberlo tenido (inmunidad).

Explicaremos cómo funcionan los diferentes tipos de pruebas y qué mide cada una de ellas para comprender mejor su utilidad.                  

¿Qué miden los diferentes tipos de pruebas?          

Para abordar este aspecto es importante comprender el proceso de la infección.

Cuando el virus entra en nuestro organismo, comienza a multiplicarse utilizando la maquinaria de nuestras células. En esta fase, el virus se puede detectar en  muestras biológicas de nuestro organismo, tales como el frotis faríngeo o nasofaríngeo, el aspirado traqueal o el lavado broncoalveolar. Hay diferentes formas de detectar la presencia del virus que comentaremos más adelante.

A los pocos días de la infección, nuestro sistema inmunitario comienza a producir anticuerpos en respuesta al agente infeccioso. Los primeros anticuerpos detectables son las inmunoglobulinas M (IgM), cuya presencia indica que la infección está en fase aguda y, por tanto, que el virus aún está en nuestro organismo.

La respuesta inmune secundaria, que incluye la producción de anticuerpos IgG e IgA, se produce más tarde, pero será la responsable de la memoria inmunitaria frente al virus. Se desconoce por el momento la duración de esta inmunidad.

Las IgG se comienzan a producir durante la fase aguda, en la que coexisten con las IgM. Sin embargo, a medida que avanza la respuesta inmune secundaria, las IgM van desapareciendo y al final solo quedarán las IgG. Cuando esto ocurre, hemos vencido la infección y estamos inmunizados. La presencia de anticuerpos es un indicador de la respuesta inmunitaria del organismo frente al virus, es decir, de haber sido infectados.      

¿Cómo funcionan las pruebas de detección?     

Existen básicamente dos tipos de pruebas de detección directa del coronavirus, aquellas que detectan el genoma del virus y aquellas que detectan sus proteínas antigénicas.

Además, la presencia del virus puede ponerse de manifiesto de forma indirecta mediante la detección de anticuerpos que, como hemos comentado anteriormente, son indicadores de la respuesta inmunitaria del organismo frente al virus.

Descripción de cada tipo de pruebas      

Pruebas de detección del genoma del virus

• La muestra utilizada para esta prueba es generalmente el frotis nasofaríngeo. Este tipo de muestra se extrae de la parte posterior de la nariz mediante un hisopo. El proceso de extracción no es doloroso, pero puede ser incómodo y causar lagrimeo o un ataque de tos.
• El método de análisis se denomina RT-PCR, siglas del término inglés para reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con transcriptasa inversa (RT). La PCR es el método habitual empleado para realizar millones de copias de un segmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) , de manera que pueda ser detectado (amplificación). Sin embargo, como el material genético del virus es ácido ribonucleico (ARN), se necesita primero copiar el ARN a ADN y esto se hace mediante la transcriptasa inversa. El proceso completo sería pues: extracción del ARN viral, copia del ARN en ADN, amplificación del ADN y detección. Las distintas pruebas de RT-PCR desarrolladas varían en función del fragmento del genoma vírico que reconocen, amplifican y detectan.
• A priori, si el resultado es positivo significa que el virus está presente en la muestra y que la persona está infectada. Si el resultado es negativo significa que la persona no está infectada. Ahora bien, la presencia del material genético del virus no implica necesariamente que el virus esté activo y sea infectivo; podría tratarse de restos del virus destruidos y no capaces de infectar. Por otro lado,  podemos encontrar resultados negativos en pacientes con sospecha clínica importante de infección. Esto último podría ser debido, por ejemplo, a que, con el progreso de la enfermedad, el virus está cada vez menos presente en la faringe y más en los pulmones, por lo que la muestra nasofaríngea podría no contener apenas virus y dar un resultado negativo. Por estos motivos, puede ser necesario realizar una segunda prueba confirmatoria.
• Las técnicas de PCR se utilizan desde hace tiempo en los laboratorios clínicos para la detección de diversos agentes infecciosos. Son técnicas complejas que requieren personal entrenado y preparado para su realización. El proceso dura unas pocas horas, pero los laboratorios clínicos disponen de analizadores que permiten realizar muchas determinaciones a la vez, con lo que el número de muestras analizadas en un día puede ser muy elevado.
• Este método de análisis es el más sensible y específico, ya que permite detectar cantidades muy pequeñas de material genético del virus (sensibilidad) y detectar así la infección en sus primeras fases, y también permite diferenciar entre microorganismos muy parecidos entre sí (especificidad).
• Recientemente se han desarrollado algunas pruebas rápidas de detección del genoma del virus que proporcionan resultados en pocos minutos y podrían ser usados en urgencias para realizar el cribado de los pacientes sintomáticos y del personal sanitario.

Pruebas de detección de antígenos virales

• La presencia del virus también puede ponerse de manifiesto a través de la detección de las proteínas antigénicas que lo recubren. La determinación se hace sobre el mismo tipo de muestras que la PCR.
• Existen diferentes procedimientos de análisis de los antígenos del coronavirus, pero todos ellos funcionan de una forma parecida. Se basan en la fijación a un soporte de anticuerpos específicos para la glucoproteína S del virus, que es la que forma las espículas que le dan el aspecto de corona por el que recibe su nombre. Si en la muestra hay partículas virales, éstas se fijarán al anticuerpo quedando así atrapadas. Entonces se añade un segundo anticuerpo contra el virus, de manera que se forme un “sándwich” anticuerpo-virus-anticuerpo. El segundo anticuerpo está marcado con algún tipo de señal que permite ponerlo de manifiesto.
• Este tipo de métodos, que forman parte de los conocidos genéricamente como métodos inmunológicos o serológicos, son muy habituales en los laboratorios clínicos y se emplean en el diagnóstico de muchas condiciones fisiológicas o enfermedades (por ejemplo: test de embarazo, pruebas de hormonas, etc.). Las diferencias entre los distintos procedimientos residen en el soporte para fijar el primer anticuerpo, los anticuerpos concretos y el marcaje del segundo anticuerpo. En el caso del coronavirus, se ha tardado un poco más en desarrollar estos métodos que los de PCR porque ha habido que esperar a que hubiese suficiente número de personas inmunizadas como para poder caracterizar los anticuerpos.
• Estos métodos tienen la ventaja de ser mucho más rápidos y de poder ser realizados en dispositivos sencillos que no requieran personal altamente cualificado, por lo que pueden ser realizados junto al paciente, incluso en el propio domicilio. Su inconveniente es que son mucho menos sensibles y específicos.
• Las comúnmente denominadas pruebas rápidas para el coronavirus se basan en este tipo de tecnología. Funcionan de forma parecida al test de embarazo.
• La interpretación de los resultados de estas pruebas es similar a las de las pruebas de PCR y con las mismas limitaciones, pero con más probabilidad de resultados erróneos debido a su menor sensibilidad y especificidad. Sin embargo, por su sencillez y facilidad de realización incluso en el propio domicilio son más adecuadas para el cribado poblacional, limitando las pruebas de PCR para aquellos pacientes que den un resultado negativo pero presenten síntomas de la enfermedad.  

 Cultivos celulares      

• Tanto las pruebas de detección del material genético del virus por PCR como las de detección de antígenos virales que acabamos de describir son incapaces de diferenciar entre virus completos e infecciosos y restos de partículas virales destruidas o de las células infectadas.
• Para comprobar la capacidad infectiva de las muestras positivas se puede inocular la muestra sospechosa a un cultivo de células. Si el virus está activo, las destruye y su efecto devastador puede visualizarse a través del microscopio. Además, se puede cuantificar por PCR el ARN viral que flota en el líquido acumulado sobre el cultivo o detectar las proteínas del virus sobre la superficie de las células infectadas mediante anticuerpos marcados. Esto último permite ver al microscopio, no tan solo las células destruidas, sino también las células aún vivas pero infectadas y que están bajo el control del virus.   

Pruebas de detección de anticuerpos

• Como se ha comentado anteriormente, el organismo reacciona frente a la infección produciendo anticuerpos (inmunoglobulinas). La detección de estos anticuerpos es un signo indirecto de la infección viral: se detecta la respuesta inmunitaria de la persona, no el virus.
• En este caso, la muestra a analizar es la sangre, que es por donde circulan los anticuerpos. Los métodos de detección son similares a los descritos anteriormente para la detección de los antígenos virales, pero lo que se fija en este caso al soporte son las proteínas antigénicas del virus (generalmente la glucoproteína S de la cubierta). Si en la muestra de sangre hay anticuerpos contra el virus, se fijarán a las proteínas virales y quedarán atrapados. A continuación se añade un segundo anticuerpo contra el anticuerpo humano. Este segundo anticuerpo acostumbra a ser un anticuerpo de un animal (los anticuerpos humanos actúan como antígenos en otros animales y reaccionan frente a ellos produciendo anticuerpos). De esta manera se forma un complejo proteína del virus-anticuerpo humano-anticuerpo animal que se detecta gracias a un marcador añadido al anticuerpo animal antes de incluirlo en la mezcla de reacción.
• Un resultado positivo de esta prueba indicaría que la persona ha estado expuesta al virus, pero no necesariamente que esté infectado. Para poder saber si aún está infectado con el virus o ya se ha curado habría que distinguir el tipo de inmunoglobulina, IgM o IgG, e interpretar los resultados conjuntamente de acuerdo al siguiente esquema:  

Los métodos de detección de anticuerpos tienen las mismas particularidades que los métodos de detección de antígenos en lo que se refiere a complejidad y rapidez y se han desarrollado métodos rápidos que pueden realizarse en pocos minutos junto al paciente. Su principal inconveniente para ser utilizados en el diagnóstico es que tienen un periodo de ventana mucho mayor, ya que el organismo tarda unos días en comenzar a fabricar anticuerpos. En cambio, son muy útiles para detectar a las personas que ya se han inmunizado, aunque no hayan tenido síntomas de la enfermedad.      

Bibliografía    

Enfermedades pulmonares          

Neumonía

Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades (CDC). Pruebas de detección del COVID-19: información importante