Métodos de laboratorio

14/11/2024

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En el laboratorio se usan una variedad de metodologías para medir las innumerables sustancias que tienen interés en la práctica clínica. La comprensión de los métodos usados para realizar una prueba concreta nos proporciona un contexto más amplio, para poder entender los resultados. A continuación realizamos una breve descripción de algunas de las técnicas más habituales.

Los métodos de laboratorio están basados en los principios establecidos e inherentes al análisis biológico, químico y físico y abarcan todos los aspectos de la Medicina de Laboratorio, desde medir la cantidad de colesterol presente en sangre hasta el análisis del ácido desoxirribonucleico (ADN) o identificar los microorganismos que causan una infección. Estos métodos son similares a las recetas de cocina, pues describen en detalle los procesos y procedimientos para medir, en las muestras biológicas, una sustancia en particular. El personal del laboratorio sigue paso a paso los procesos hasta que se obtiene el resultado de la prueba.

Algunos métodos, como algunas recetas de cocina, son más complejos y laboriosos que otros, y requieren un mayor grado de conocimiento por parte del personal del laboratorio. A menudo, existe más de un método para medir la misma sustancia y, consecuentemente, una misma sustancia puede medirse de forma diferente en diferentes laboratorios, hecho crucial a la hora de comparar los resultados obtenidos en diferentes laboratorios.

La descripción de los métodos descritos a continuación, intenta dar una visión de los principios científicos usados y de los pasos requeridos para obtener un resultado. La explicación de los métodos y sus diferencias, se incluyen para proporcionar al paciente una mejor comprensión de las pruebas que puedan haberle realizado. No se pretende realizar una descripción exhaustiva de las metodologías disponibles, sino de aquellas que se mencionan en esta página web y que se utilizan con mayor frecuencia.

En el laboratorio clínico se utilizan otras muchas técnicas que no se describen aquí, como las técnicas coagulométricas, la microscopía, contadores celulares, etc…

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Espectrofotometría de absorción molecular UV-VIS

La espectrofotometría de absorción molecular es una de las técnicas más empleada en los laboratorios, ya que es una técnica sencilla y precisa. Su fundamento se basa en medir la cantidad de luz absorbida a una determinada longitud de onda, por la sustancia que se quiere cuantificar cuando un haz luminoso pasa a través de la muestra. Cada sustancia absorbe la luz de diferente manera en función de su estructura molecular, lo que permite diferenciar unas de otras y poder seleccionar las adecuadas.

Esta técnica se emplea para la medida de sustancias como el colesterol total, la creatinina, el calcio, etc....

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Espectrometría de masas

La espectrometría de masas (MS) es un principio de medida que permite separar, identificar y cuantificar de manera inequívoca los componentes de una muestra en función de dos propiedades de la materia: la masa y la carga. La combinación de la HPLC y la MS presenta una elevada capacidad para separar, aislar, identificar y cuantificar diferentes componentes de una muestra. En los últimos años, la aplicación de la HPLC en los laboratorios clínicos ha adquirido un papel relevante debido, principalmente, a la aparición de sistemas de medida que combinan la HPLC con sistemas de detección específicos y con una elevada capacidad de detección como son los espectrómetros de masas. Estas características han hecho que en la actualidad se los considere procedimientos de medida de referencia.

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Cromatografía

La cromatografía se fundamenta en el principio físico-químico de separación, en el que los componentes a separar de una muestra se distribuyen entre dos fases, una que se encuentra inmóvil (fase estacionaria) y otra que circula en una dirección determinada (fase móvil). Se utiliza para separar diferentes sustancias de una mezcla. La fase móvil puede ser un gas o un líquido que hace pasar la mezcla que se quiere separar por una columna, papel o placa especial que hará de separador.

Es una técnica también muy utilizada por su capacidad de detección, pero necesita tecnología más avanzada y personal experimentado para su uso. Se emplea para medir diversos compuestos como vitaminas, hormonas, fármacos y tóxicos.

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Cromatografía líquida de alta resolución

La cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) es un principio de medida que permite separar los componentes de una muestra en función de su distribución entre dos fases inmiscibles entre sí: una fase estacionaria (un soporte sólido) y una fase móvil (un líquido). La muestra es inyectada en la fase móvil, en la que es soluble, e impulsada a una elevada presión a través de una columna que contiene la fase estacionaria. Una vez separados los diferentes componentes en el sistema cromatográfico, y en función de sus propiedades físico-químicas, estos pueden ser identificados o cuantificados empleando alguno de los múltiples dispositivos de detección existentes.

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Electroforesis

La electroforesis es una técnica de laboratorio que se usa para separar moléculas basándose en su diferente tamaño y carga. Se utiliza especialmente para separar proteínas, ADN y ARN. Consiste en colocar las moléculas en un soporte de gel y al que se le aplica una corriente eléctrica; en función de la carga y tamaño de las moléculas, estas migrarán de diferente manera. Las moléculas cargadas positivamente migrarán hacia el cátodo o polo negativo, mientras que las moléculas con carga negativa se moverán el ánodo o polo positivo. Mediante unos patrones de migración se podrán identificar cual las moléculas. Se utiliza, por ejemplo, para el estudio del perfil de proteínas (proteinograma) en el suero del paciente.

Potenciometría

La potenciometría se emplea en los laboratorios clínicos para medir la concentración de sustancias como los iones sodio, potasio o cloro. Se pueden medir especies electroactivas en una solución empleando un electrodo de referencia y un electrodo de medida (específico para el componente que se mide). Se utiliza un potenciómetro que mide la diferencia de potencial entre los dos electrodos.

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Turbidimetría

Esta técnica utiliza la propiedad de las moléculas para absorber y dispersar la luz cuando se hace pasar un rayo de luz por la solución en que están disueltas.

Lo que se determina es la forma en que se atenúa la luz, que depende del tamaño de las partículas y su concentración en la suspensión. Es una técnica bastante sencilla y que está incluida en muchos autoanalizadores. Se emplea la turbidimetría para medir compuestos como alguna proteínas.

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Inmunoensayos

Aspectos básicos

Las inmunoglobulinas o anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunitario para reconocer, unirse y neutralizar sustancias extrañas al cuerpo (antígenos). Los inmunoensayos son pruebas basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a las sustancias que reconocen o que han inducido su producción (antígenos). Pueden utilizarse para evaluar la presencia, o medir, tanto un antígeno como un anticuerpo específico, en cualquier fluido biológico del paciente.

Si el inmunoensayo se utiliza para determinar la presencia de un anticuerpo, en sangre u otro fluido, se introduce en el análisis el antígeno contra el que actúa, entre otras sustancias. Si el anticuerpo que estamos buscando existe en la muestra, reaccionará o se unirá al antígeno de la prueba y se obtendrá un resultado positivo. Si no se produce la reacción, el resultado será negativo. Ejemplos de estas pruebas pueden ser el factor reumatoide, (identifica anticuerpos del propio paciente en la artritis reumatoide), anticuerpos contra el virus del Nilo Occidental, o los anticuerpos producidos tras una vacuna, para comprobar la eficacia de la inmunización.

Si lo utilizamos para detectar la presencia de un antígeno, tanto en sangre como en otro fluido, la prueba utiliza anticuerpos contra el antígeno de interés. En este caso la reacción del antígeno de la muestra del paciente suele compararse con una serie de patrones que contienen el antígeno a concentraciones conocidas, para poder cuantificar la cantidad de antígeno presente en la muestra del paciente. Ejemplos de estos inmunoensayos incluyen la concentración de hormonas, como la insulina o las hormonas sexuales, fármacos como los antiepilépticos (carbamazepina, fenitoína, etc..) o antibióticos, o marcadores tumorales como el antígeno carcinoembrionario (CEA), el antígeno prostático específico (PSA) o la alfa-fetoproteína.

Inmunoensayo asociado (ligado) a enzimas (ELISA)

Se trata de una variante de inmunoensayo que utiliza enzimas como marcadores, uniéndolos o bien al anticuerpo o bien al antígeno. El desarrollo posterior de la reacción enzimática propia del enzima utilizado permite medir la señal producida y compararla con la curva patrón y cuantificar la sustancia de interés en la muestra del paciente.

Para detectar o medir un anticuerpo en la sangre de un paciente se prepara una superficie o pocillo al que se une el antígeno que reconoce este anticuerpo, a continuación se añade la muestra del paciente por lo que si el anticuerpo está presente se unirá al antígeno. A continuación, se añade un anticuerpo contra el anticuerpo humano, marcado con un enzima. Si el anticuerpo con enzima se une al anticuerpo del paciente fijado, se producirá la reacción enzimática y habrá señal. Esta señal indicará la presencia del anticuerpo y además, si se compara con la señal obtenida con concentraciones conocidas del anticuerpo, se podrá cuantificar el anticuerpo del paciente.

Western blot

Se trata de un tipo de inmunoensayo que detecta proteínas específicas en suero o tejidos. Combina la electroforesis (separación de proteínas por efecto de un campo eléctrico), con la posterior transferencia de las proteínas separadas a una membrana, que después se incuba con el anticuerpo contra la proteína que queremos medir asociada a un enzima.

Se pueden analizar simultáneamente muestras de varios pacientes junto a una muestra control. La electroforesis separa las proteínas de cada muestra por tamaño y forma, dando lugar a bandas que en conjunto producen una imagen similar a los peldaños de una escalera. Las escaleras de las muestras de pacientes y de la muestra control se transfieren a una membrana y esta se incuba con el complejo anticuerpo-enzima, para detectar la presencia de la proteína objeto de estudio en los pacientes.

A menudo esta técnica se usa para detectar anticuerpos o confirmar su presencia con fines diagnósticos. Un ejemplo podría ser la detección de la enfermedad de Lyme, o confirmar la presencia de proteínas del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). La presencia de estas proteínas se interpreta por comparación con muestras conocidas, positivas y negativas, analizadas simultáneamente.

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Diagnóstico genético

En el laboratorio se utilizan diversas técnicas avanzadas de diagnóstico molecular, para detectar las alteraciones genéticas relacionadas con las enfermedades hereditarias y adquiridas. Los métodos principales y más comúnmente empleados son: reacción en cadena de la polimerasa de tripletes cebados (TP-PCR), secuenciación de Sanger y secuenciación de nueva generación (NGS). Permiten identificar con precisión cambios genéticos que podrían tener un impacto importante en la salud. A continuación, se explica cómo funciona cada técnica y qué tipo de enfermedades pueden diagnosticarse con ellas.

1. TP-PCR (reacción en cadena de la polimerasa de tripletes cebados)‍

¿Para qué se utiliza?

La TP-PCR es una técnica clave para diagnosticar las enfermedades relacionadas con expansiones en el ácido desoxirribonucleico (ADN). Ocurren en las secuencias cortas de nucleótidos (mononucleótidos, dinucleótidos, trinucleótidos, hasta hexanucleótidos) repetidas de nuestro ADN, conocidas como microsatélites. Un aumento en el número normal de estas secuencias se conoce como expansión. En muchos casos, estas expansiones suelen ser secuencias de tres letras genéticas (tripletes), que cuando se repiten en exceso pueden causar enfermedades. Entre las condiciones más comunes diagnosticadas con esta técnica se encuentran:

Síndrome de X frágil: una causa frecuente de discapacidad intelectual y trastornos del espectro autista.
Distrofia miotónica tipo 1: una enfermedad muscular hereditaria que afecta a la fuerza y al funcionamiento de los músculos.
Enfermedad de Huntington: un trastorno neurodegenerativo progresivo que afecta al movimiento, al pensamiento y al comportamiento.

¿Cómo funciona?

En este método, se toma una muestra de ADN del paciente, que luego se amplifica para analizar el número de repeticiones de los microsatélites de genes específicos. Un exceso de repeticiones en ciertos genes es característico de algunas enfermedades. Al medir la cantidad de repeticiones, se puede confirmar si el paciente tiene una expansión genética anómala, ayudando así al diagnóstico de la enfermedad.

2. Secuenciación de Sanger

¿Para qué se utiliza?

La secuenciación de Sanger es un método robusto y preciso que se emplea para confirmar mutaciones específicas en genes individuales. Este método es ideal para diagnosticar enfermedades que se asocian con alteraciones genéticas previamente conocidas y para el estudio de variantes genéticas familiares. Algunas de las enfermedades que se suelen evaluar con la secuenciación de Sanger incluyen:

Fibrosis quística: causada por mutaciones en el gen CFTR, que afecta a las glándulas mucosas y sudoríparas.
Hemocromatosis hereditaria tipo 1: una enfermedad que produce acumulación excesiva de hierro en el organismo, debido a mutaciones en el gen HFE.
Síndrome de Marfan: un trastorno del tejido conectivo relacionado con mutaciones en el gen FBN1.

¿Cómo funciona?

Este proceso consiste en “leer” directamente la secuencia de ADN en la región del gen sospechoso de llevar una mutación. En el caso de enfermedades como la fibrosis quística, se puede analizar específicamente el gen CFTR para detectar las mutaciones más comunes asociadas con esta condición. Es una técnica ideal cuando se sospecha una mutación concreta y se desea confirmar su presencia en el paciente.

3. Secuenciación de nueva generación o secuenciación masiva (NGS)

¿Para qué se utiliza?

La NGS es una herramienta poderosa que permite analizar múltiples genes simultáneamente. Es especialmente útil en casos donde es necesario evaluar un gran número de genes o donde una misma enfermedad puede estar asociada a mutaciones en genes de gran tamaño o en varios genes distintos. Las aplicaciones de la NGS incluyen el diagnóstico de enfermedades genéticas complejas, como:

Cáncer hereditario: por ejemplo, detección de mutaciones en los genes BRCA1 y BRCA2 asociados al cáncer de mama y ovario hereditario.
Epilepsia: ciertos tipos de epilepsia tienen bases genéticas que se pueden identificar a través de paneles multigénicos.
Cardiomiopatía: una enfermedad cardiaca que puede estar relacionada con mutaciones en varios genes distintos.

¿Cómo funciona?

En la NGS, el ADN se rompe en millones de pequeños fragmentos que luego se analizan simultáneamente para generar un “mapa” genético completo del paciente. Esta técnica permite detectar mutaciones en varios genes a la vez, lo que es particularmente útil en enfermedades complejas. Por ejemplo, para evaluar el riesgo hereditario de ciertos tipos de cáncer, podemos analizar simultáneamente una serie de genes asociados al cáncer, obteniendo un perfil genético detallado que puede guiar las decisiones de prevención y tratamiento.

4. Otras técnicas

Además de la TP-PCR, la secuenciación de Sanger y la secuenciación de nueva generación (NGS) existen otras técnicas de laboratorio utilizadas para detectar y caracterizar alteraciones genéticas, cromosómicas o celulares en diversas patologías. A continuación, se resumen algunas de las más relevantes:

Cariotipo e hibridación in situ fluorescente (FISH): estas técnicas se utilizan principalmente para detectar alteraciones cromosómicas. El cariotipo es una prueba que consiste en que después de varios días de cultivo celular, los cromosomas se extienden y fijan en un portaobjetos y posteriormente se tiñen. La técnica permite observar al microscopio el conjunto completo de cromosomas de una célula, organizados y ordenados por tamaño, forma y número. Con esta técnica, se pueden identificar anomalías numéricas, como la trisomía 21 en el síndrome de Down y alteraciones estructurales de gran tamaño, como deleciones, duplicaciones, translocaciones o inversiones. Por otro lado, sondas fluorescentes que se unen a secuencias específicas de ADN, permitiendo identificar al microscopio, alteraciones cromosómicas numéricas y alteraciones estructurales de menor tamaño que el cariotipo. Se usa comúnmente en el diagnóstico de síndromes de microdeleción y ciertos tipos de cáncer, como leucemias y tumores sólidos con reorganizaciones cromosómicas específicas. Estas dos técnicas son complementarias, ya que el cariotipo permite un análisis global de los cromosomas, mientras que la FISH aporta una mayor precisión en el diagnóstico de alteraciones a nivel molecular.
‍Hibridación genómica comparativa (array CGH): el ADN del paciente y un ADN control se marcan con un fluorocromo distinto (normalmente verde y rojo, respectivamente) y ambos tipos de ADN competirán por unirse a las miles de sondas específicas fijadas en un portaobjetos, según el color obtenido podremos detectar ganancia o pérdida de material genético. Esta técnica permite detectar deleciones y duplicaciones a lo largo de todo el genoma con gran resolución y rapidez. Sus aplicaciones son el diagnóstico, tanto prenatal como postnatal, de síndromes de microdeleción o microduplicación y el estudio de tumores para clasificarlos, determinar su pronóstico y optimizar su tratamiento.‍
Test prenatal no invasivo: esta técnica permite analizar el ADN del feto a través de una muestra de sangre de la madre. Su mayor utilidad es el cribado prenatal de las principales alteraciones cromosómicas numéricas (trisomías 21, 18 y 13).
‍PCR con transcriptasa Inversa (RT-PCR): esta técnica amplifica el ácido ribonucleico (ARN) a partir de una muestra y luego lo convierte en ADN mediante la transcriptasa inversa, permitiendo detectar infecciones virales causadas por virus de ARN, como el SARS-CoV-2. También es útil para medir la expresión génica en enfermedades genéticas y cáncer.
‍PCR en tiempo real o cuantitativa (qPCR) y PCR cuantitativa con transcriptasa inversa (RT-qPCR): es una variante de la PCR que permite cuantificar en tiempo real la cantidad de ADN o ARN en una muestra, siendo útil, tanto para medir la carga viral en infecciones (por ejemplo: VIH), como para el diagnóstico y seguimiento del cáncer y enfermedades hereditarias.
‍Secuenciación completa del exoma (WES) y secuenciación completa del genoma (WGS): estas técnicas avanzadas permiten analizar en detalle todas las regiones codificantes del ADN (WES) o el genoma completo (WGS), respectivamente. Son útiles para el diagnóstico de enfermedades genéticas complejas y los casos en los que otros métodos no han logrado un diagnóstico preciso.

Estas técnicas complementan el diagnóstico molecular en diversas áreas, proporcionando información detallada para el diagnóstico, pronóstico y orientación en el tratamiento de una amplia variedad de condiciones genéticas, infecciosas y oncológicas.

Estas tecnologías en su conjunto permiten ofrecer diagnósticos genéticos confiables y precisos, brindando a los clínicos la información necesaria para proponer tratamientos personalizados y guiar el seguimiento de los pacientes.

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